Control of terminal erythroid differentiation : involvement of ribosome biogenesis
Contrôle de la différenciation érythroïde terminale : implication de la biogenèse des ribosomes
Résumé
Ribosome biogenesis is the complex process ensuring protein synthesis, which is essential for cell growth and proliferation. Ribosomopathies such as Blackfan-Diamond anemia and acquired 5qmyelodysplastic syndrome are caused by ribosomal protein-coding gene mutation or deletion. The major symptom of these two pathologies is hypoplastic anemia. To understand the erythroid tropism of ribosomopathies, we studied ribosome biogenesis and the consequences of its inhibition during normal human erythropoiesis. We first determined the kinetic of ribosome biogenesis during erythropoiesis. For this, we developed a proteomic technique (Pulse Silac) allowing identification and quantification of ribosomal protein renewal in human primary erythroblasts. We show that ribosome biogenesis collapses from the basophilic erythroblast stage onwards. Premature inhibition of ribosome biogenesis in immature precursors by a RNA pol I specific inhibitor, CX-5461, leads to an acceleration of erythroid differentiation. These results highlight the role of ribosome biogenesis in erythropoiesis. Then, we explored determinants of erythroid differentiation while ribosome biogenesis is stops. We observe that ribosome biogenesis arrest is concomitant with an activation of the p53 protein, and its related target genes specifically which are involved in DNA damage response and cell cycle arrest are activated, as identified by ChIP-seq. Finally, we explored the mechanisms upstream of p53 activation upon ribosome biogenesis inhibition. We show that CHK1 activation is concomitant with p53 activation, and inhibition of p53 activation by a specific ATR inhibitor suggests the involvement of the ATR/CHK1/p53 repair pathway during erythropoiesis. In addition, the structure of the nucleolus, major site for ribosome biogenesis, evolves from active nucleoli to an inactive micronucleolus during erythroid differentiation. These results suggest that erythroid differentiation could induce nucleolar stress that triggers ATR/CHK1/p53 repair pathway activation and cell cycle arrest. In addition, two models mimicking the 5q- syndrome have been developed in the UT-7/EPO and K562 cell lines, whose ribosomal protein gene RPS14 expression was targeted by shRNA strategy. Decreased expression of RPS14 leads to a decrease of ribosome cellular content by half and selective translation at the expense of the major erythroid transcription factor GATA1. In order to explore the parameters that govern global translation in these models, we analyzed transcripts bound on polysomes. This analysis suggests that short length transcripts, with a highly structured 3'UTR, and a high proportion of optimal codons are the most affected in translation efficiency. In addition, the integrated analysis of transcriptomic and proteomic data generated in UT-7/EPO shRPS14 cells confirms that post-transcriptional regulation of gene expression is directly related to these selective criteria of translation. In addition, we studied translation regulation during normal erythropoiesis. We showed that most abundant proteins in mature erythroid stages correspond to short-sequence transcripts, with a high rate of optimal codons. These results indicate that these transcripts possess optimal characteristics for an effective translation under normal conditions, but that those are deleterious under ribosome limited availability condition. In conclusion, this work shows that ribosome biogenesis decreases during erythropoiesis and controls terminal erythroid differentiation. The repair pathway involving both the CHK1 kinase and p53 appears to regulate terminal erythroid differentiation. Also, we have shown that RPS14 haploinsufficiency leads to translation selectivity at the expense of short and highly structured transcripts containing a high proportion of optimal codons.
La biogenèse du ribosome est un processus complexe qui assure la synthèse protéique indispensable à la croissance et la prolifération cellulaire. Les ribosomopathies telles que l’anémie de Blackfan-Diamond et le syndrome myélodysplasique 5q- sont associées à une mutation ou une délétion d’un gène codant une protéine ribosomique. Le symptôme dominant de ces deux pathologies est une anémie hypoplasique. Pour comprendre le tropisme érythroïde des ribosomopathies, nous avons étudié la biogenèse des ribosomes et les conséquences de son inhibition au cours de l’érythropoïèse humaine normale. D’une part, nous avons déterminé la cinétique de la biogenèse des ribosomes au cours de l’érythropoïèse. Pour cela, nous avons développé une technique de protéomique (Pulse Silac) permettant l’identification et la quantification du renouvellement des protéines ribosomiques au sein d’échantillons d’érythroblastes primaires humains. Ainsi, nous avons mis en évidence un effondrement de la biogenèse des ribosomes à partir du stade érythroblaste basophile. L’inhibition prématurée de la biogenèse du ribosome dans les précurseurs immatures grâce à un inhibiteur spécifique de l’ARN pol I, le CX-5461, conduit à une accélération de la différenciation érythroïde. Ces résultats soulignent un rôle de la biogenèse des ribosomes dans l’érythropoïèse. Puis, nous avons exploré les déterminants de la différenciation érythroïde lorsque la biogenèse des ribosomes s’arrête. Nous observons que cet arrêt est concomitant à une activation de la protéine p53 et de ses gènes cibles spécifiquement impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN et dans l’arrêt du cycle cellulaire, identifiés par ChIP-seq. Enfin, nous avons exploré le mécanisme d’activation de p53 lors de l’arrêt de la biogenèse des ribosomes. La phosphorylation de CHK1 sur la sérine 345, concomitante à l’activation de p53, et l’inhibition de l’activation de p53 par un inhibiteur spécifique d’ATR suggèrent l’implication de la voie de réparation ATR/CHK1/p53. De plus, au cours de la différenciation érythroïde, la structure du nucléole, lieu de biogenèse du ribosome, évolue de nucléoles actifs vers un micronucléole inactif. Ces résultats suggèrent que la différenciation érythroïde pourrait provoquer un stress nucléolaire induisant l’activation de la voie de réparation ATR/CHK1/p53 et un arrêt du cycle cellulaire. En parallèle, deux modèles mimant le syndrome 5q- ont été développés dans les lignées cellulaires UT-7/EPO et K562, dont l’expression du gène codant la protéine ribosomique RPS14 est ciblée par stratégie shARN. La diminution d’expression de RPS14 conduit à une réduction de moitié du contenu cellulaire en ribosomes et une traduction sélective au détriment du facteur de transcription érythroïde majeur GATA1. Afin d’explorer les paramètres qui gouvernent la traduction globale dans ces modèles, nous avons analysé les transcrits exprimés sur les polysomes. Ainsi, il apparaît que les transcrits caractérisés par une courte séquence, avec une extrémité 3’UTR hautement structurée, et un taux élevé de codons optimaux sont les plus affectés en terme d’efficacité de traduction. De plus, une analyse intégrée du transcriptome et du protéome des cellules UT-7/EPO shRPS14 confirme que la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes est directement liée à ces critères de sélectivité de traduction. Par ailleurs, nous avons étudié la régulation de la traduction au cours de l’érythropoïèse normale. Nous montrons que les protéines les plus abondantes dans les stades érythroïdes matures correspondent à des transcrits de courte séquence, et avec un taux élevé de codons optimaux. Ces résultats indiquent que les transcrits codant pour les protéines qui s’accumulent au cours de l’érythropoïèse possèdent des caractéristiques optimales pour la traduction en conditions physiologiques, mais qui s’avèrent délétères en condition de disponibilité limitée en ribosomes. (...)
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|